蝦青素對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

蝦青素對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

作者：裴凌鵬

作者單位：中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081

【摘要】 目的研究ASTA蝦青素對脂多糖（LPS）所致急性肺損傷（ALI）小鼠的保護作用。方法雄性昆明種小鼠60只，隨機分為正常對照組、急性肺損傷模型組、地塞米松陽性對照組(5 mg/kg)以及蝦青素低、中、高劑量組(10、15、20 mg/kg)共6組。不同劑量蝦青素給大鼠連續灌胃30 d后，腹腔注射脂多糖6.0 mg/kg建立ALI模型。在注射后6 h，收集腹主動脈血并進行左側支氣管肺泡原位灌洗以收集灌洗液，測定血中淋巴細胞亞群（CD+3、CD+4、CD+8）、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素8(IL8)及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性；測定各組的肺濕重/干重比、肺組織中性粒細胞髓過氧化物酶(MPO)含量及肺組織勻漿TNFα、白細胞介素10(IL10)含量。結果蝦青素各劑量組均能降低因LPS誘發的血TNFα、IL8、MPO、MDA含量與肺組織濕重/干重比的升高，同時抑制肺組織IL10含量、血SOD與GSHPx活性的降低，改善血中淋巴細胞亞群分布。結論蝦青素對LPS所致ALI具有預防性保護作用。

【關鍵詞】 蝦青素；急性肺損傷；脂多糖

急性肺損傷(ALI)是全身炎癥導致多器官功能障礙綜合征的肺部表現，其嚴重階段即為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。研究表明，在ALI/ARDS的發生發展中，免疫細胞功能紊亂和免疫炎性因子失衡在致病過程中作用顯著。蝦青素是一種類胡蘿卜素，主要以全反式異構體形式存在于自然界海洋動物體、藻體及多數陸生植物體（如冰涼花）內并具有多種生物學功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出。由于蝦青素國際市場需求的日益增加，針對其潛在防病、治病功能的研究越發引人關注，在以往流行病學統計中就蝦青素為預防與治療呼吸性疾病提供幫助的可能性僅有零星報道，但尚存在一定的爭議。為此圍繞此類課題開展研究顯然具有很重要的理論與臨床意義。因此，本實驗旨在通過ASTA蝦青素對脂多糖誘導小鼠ALI模型進行研究，初步揭示其對此類損傷潛在的預防保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Labconco冰凍真空干燥儀（法國樂高公司），752分光光度計（中國伯樂公司），960型熒光分光光度計、J2SH高速冰凍離心機（日本島津公司），C30柱（YMC Carotenoid S5，Waters），HPLC（Waters 600E溶劑輸送系統，PDA2996二極管陣列檢測器Waters），脂多糖、地塞米松（美國SIGMA），FITC標記的抗大鼠CD3單克隆抗體、PE標記的抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體(美國Caltag公司)，小鼠TNFαELISA試劑盒(武漢博士德公司)，小鼠IL8、IL10 ELISA試劑盒(美國RB公司)，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒及髓過氧化酶(MPO)測定試劑盒(南京建成生物工程公司)，蝦青素乳化顆粒（瑞士羅氏DMS公司），乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）（美國迪馬公司），大孔吸附樹脂（天津農業股份公司）。

1.2 乳化劑破乳制備蝦青素

1.2.1 有機萃取稱取10 g乳化顆粒加入少許水，超聲波促溶后，加入300 ml丙酮正己烷萃取。靜置2 h后，將脂溶性相收集（反復萃取直至水相成無色）。再利用減壓旋轉蒸發儀進行提取液濃縮處理。

1.2.2 蝦青素提取液柱色譜純化 ①裝柱。將活化好的氧化鋁裝填于玻璃層析柱中，裝填高度為12 cm，用正己烷潤濕。②洗脫。分別取2 ml蝦青素提取液上柱，用50 ml正己烷丙酮淋洗，收集洗脫液。將洗脫液用氮氣吹干制粉，裝入充滿氮氣的玻璃瓶內，-70℃儲存備用。

1.3 蝦青素鑒定 參照全反式蝦青素標準品，根據其HPLC中保留時間和紫外可見吸收光譜的特征峰進行鑒定。得到的蝦青素提取液經過濾后用高效液相色譜分離。色譜條件：色譜柱：Waters YMC Carotenoid S5(4.6 mm×250 mm)；流動相A：乙腈甲醇（V∶V=75∶25）；流動相B：MTBE；流動相A與B中分別加入0.05%三乙胺作為改性劑防止蝦青素降解；線性梯度洗脫：B在8 min內由0%增加至55%；8～35 min B維持55%；35～40 min B由55%減至0%；流速：1.0 ml/min;檢測波長：l/nm=480；波長范圍260～700 nm；進樣量：20 μl。并收集后觀察其光譜特征峰行為。通過色譜和光譜分析結果表明實驗所用灌胃物為全反式蝦青素，純度為95%。

1.4 動物實驗

1.4.1 ALI模型的建立與動物分組實驗小鼠（購自中國軍事醫學科學院實驗動物養殖中心）按體重隨機分為6組：正常對照組、ALT模型組、蝦青素低、中、高劑量組（10、15、20 mg/kg）和陽性對照組（地塞米松5 mg/kg），每組10只。蝦青素組動物每天給予不同劑量的蝦青素，正常對照組、ALI模型、陽性對照組給予溶劑(食用色拉油)，連續灌胃30 d，每周稱體重1次，根據體重調整灌胃量。30 d后，各劑量蝦青素組、ALI模型組、陽性對照組小鼠分別腹腔注射LPS 6.0 mg/kg，建立ALI動物模型，正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水。造模6 h后，股動脈放血處死，結扎右肺，暴露氣管進行氣管插管，用生理鹽水1.5 ml分3次進行支氣管肺泡灌洗，收集BALF，取BALF離心后上清2 ml冷凍干燥成干粉；并收集小鼠腹主動脈血.

1.4.2 肺濕重/干重比測定各組小鼠開胸取全部左肺，濾紙吸干，稱量濕重，60℃烘烤48 h，稱量干重，計算肺組織濕重/干重(W/D)。

1.4.3 肺組織TNFα、IL10及MPO的測定取肺組織勻漿液，采用酶聯免疫吸附法測定各組小鼠肺組織中TNFα及IL10的含量。按試劑盒說明書測定MPO，測定過程中需注意低溫及避光操作。

1.4.4 動脈血T淋巴細胞亞群CD+3，CD+4和CD+8的檢測采集小鼠腹主動脈血2.0 ml，EDTA抗凝后分別取60 μl加入2個流式細胞儀檢測專用試管中。具體操作參照文獻〔4〕，并嚴格按試劑說明書進行。

1.4.5 動脈血抗氧化指標檢測經3 000 r/min離心10 min，分離血清，測定各組血清中SOD、GSHPx、MDA水平。MDA含量測定方法：硫代巴比妥酸（TBA）比色法；SOD活性測定方法：亞硝酸鹽法；GSHPx活性測定方法：5，5雙硫代對硝基苯甲酸（DTNB）顯色法。

1.4.6 TNFα和IL8的檢測采用酶聯免疫吸附法測定，用生理鹽水300 μl溶解BALF冷凍干粉，分別用TNFα和IL8酶聯免疫測定試劑盒，測定該溶液中TNFα和IL8含量。

1.5 統計處理 所有數據用x±s表示，用SPSS10.0統計軟件進行統計，組間差異比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 蝦青素對肺組織W/D的影響 與對照組(W/D=4.21)相比，ALI模型組（W/D=5.12），W/D值顯著升高(P＜0.01)；與ALT模型組比較，蝦青素各劑量組和陽性對照組W/D則分別降低至5.01（蝦青素低劑量組）、4.79（蝦青素中劑量組）、4.47（蝦青素高劑量組）、4.30（陽性對照組），差異顯著(P＜0.01)，并顯示出一定的量效關系；但蝦青素組的療效不如陽性對照組(P＜0.05)。

2.2 肺組織TNFα、IL10及MPO的測定 表1可見，與對照組比較，ALI模型組小鼠肺組織TNFα、MPO含量顯著升高，而IL10含量顯著降低(均P＜0.01)。與ALI模型組比較，蝦青素各劑量組和陽性對照組IL10含量明顯升高，TNFα、MPO含量明顯降低(均P＜0.01)，顯示出一定的量效關系；但蝦青素組的療效不如陽性對照組(P＜0.01)。

2.3 動脈血T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4和CD+8的檢測 表2可見，與對照組比較，ALI模型組小鼠動脈血中T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4和CD+8含量顯著降低(P＜0.01)。而與ALI模型組比較，蝦青素各劑量組和陽性對照組T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4和CD+8明顯升高(P＜0.01)，顯示出一定的量效關系；蝦青素組的療效不如陽性對照組(P＜0.01)。

2.4 動脈血抗氧化指標檢測 表3可見，與對照組比較，ALI模型組小鼠血中SOD、GSHPx活性顯著降低，而MDA含量顯著增加(均P＜0.01)。而與ALI模型組比較，蝦青素各劑量組和陽性對照組血中SOD、GSHPx活性明顯升高，MDA含量明顯降低(均P＜0.01)，顯示出一定的量效關系；但蝦青素組的療效不如陽性對照組(P＜0.01)。表1 各組肺組織TNFα、IL10及MPO含量與正常對照組相比：1）P＜0.01；與ALI模型組相比：2）P＜0.01；與陽性對照組相比：3）P＜0.01，下表同表2 各組小鼠動脈血T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4和CD+8變化表3 各組小鼠血清SOD、GSHPx活性和MDA含量

2.5 TNFα和IL8的檢測 表4可見，與對照組比較，ALI模型組小鼠肺組織BALF中TNFα、IL8含量顯著升高(P＜0.01)。與ALI模型組比較，蝦青素各劑量組和地塞米松陽性組TNFα、IL8含量明顯降低(均P＜0.01)，顯示出一定的量效關系；但蝦青素組的療效不如陽性對照組(P＜0.01)。表4 各組小鼠肺BALF中TNFα、IL8含量

3 討論

誘發ALI的因素眾多，但無論開始的刺激因素是細菌性還是非細菌性，其引起的幾乎都是一種不易調控的全身性免疫紊亂，免疫細胞過度活化和免疫炎性因子大量釋放，導致病理損傷。機體在嚴重的細菌感染、創傷、燒傷或應激狀態下，大量的內毒素與巨噬細胞表面受體結合，巨噬細胞被過度活化，釋放大量炎性細胞因子，引起系統性炎性反應綜合征(SIRS)，最終導致機體的病理損害甚至死亡。

研究表明當機體攝入LPS，體內肺組織細胞中的自由基代謝平衡就會失調，對自由基的防御能力也會下降，過量自由基可使生物膜脂質雙分子層中的不飽和脂肪酸過氧化，而形成脂質過氧化產物，從而使膜結構和功能發生障礙。過氧化脂質的代謝產物MDA，進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯，生成無活性脂褐質，沉積于組織細胞，破壞細胞膜結構，最后導致細胞無法維持正常代謝而死亡。本實驗的結果表明，與ALI模型組比較，蝦青素各劑量組均升高血SOD、GSHPx活性，降低MDA含量，說明蝦青素可以改善LPS所致ALI模型小鼠抗氧化能力。

T細胞對機體細胞免疫和體液免疫類型、強度都有重要調節作用，T淋巴細胞亞群的測定有助于了解機體免疫狀況及一些疾病的監測。CD+3反應總T細胞；CD+4分布于T細胞的輔助細胞誘導亞群和抑制細胞誘導亞群表面，其主要生理功能是誘導B淋巴細胞增生和分化產生抗體，誘導和輔助細胞毒T細胞前身成為細胞毒T細胞，輔助性T淋巴細胞主要通過分泌細胞因子調節殺傷淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等活性； CD+8分布在抑制性和殺傷性T淋巴細胞表面，CD+8通過自身和抑制因子在免疫反應中起負向調節作用，是機體免疫和調節的重要因素。T細胞調控網絡失去平衡，可導致機體發病，如輔助性T細胞功能低下，機體易發生感染，抑制性T細胞功能低下可能發生過強免疫反應。本研究結果顯示，ALI模型組小鼠CD+3、CD+4、CD+8有降低趨勢，而蝦青素不同劑量組均高于ALI模型組。

TNFα是ALI炎癥反應中重要的啟動因子，也是介導早期ALI的主要細胞因子。它可以直接損傷肺血管內皮細胞，活化中性粒細胞(PMN)，使得PMN黏附并脫顆粒及呼吸爆發，造成肺組織損傷，并能刺激IL1、IL6、IL8等的產生，形成縱橫交錯的細胞因子作用網絡，介導炎癥反應損傷肺組織。IL8是PMN最有效和最主要的趨化因子。在游離IL8形成的濃度梯度的趨化下，PMN穿過內皮進入肺間質與肺泡腔，到達肺組織的PMN繼續受到IL8的強烈刺激，發生呼吸爆發和脫顆�，F象，釋放出大量的損傷介質引起肺損傷。ALI時IL8升高較晚但持續時間長，因此IL8在ALI發病后期損傷及預后轉歸上起著更為重要的作用。而IL10為抗炎因子，主要是由單核/巨噬細胞、T細胞、B細胞產生，影響前炎癥細胞因子的產生。本實驗表明：蝦青素呈劑量依賴性地抑制TNFα、IL8的分泌，而提高IL10。

綜上所述，蝦青素能降低由于LPS誘發的肺組織W/D、TNFα、IL8、MPO活性升高，增強IL10分泌與抗氧化能力，改善T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4、CD+8分布，表明蝦青素可能通過調節促炎性因子、抗炎因子的釋放以及拮抗氧應激對肺組織產生保護作用，其確切機制有待進一步研究。此外，ASTA蝦青素雖作用效果略遜于地塞米松，但由于其是一種天然食用安全的化合物，所以未來應用前景更顯優勢。