蝦青素對D-半乳糖老齡大鼠骨質影響 - 荊州市天然蝦青素有限公司

蝦青素對D-半乳糖老齡大鼠骨質影響

蝦青素對D-半乳糖老齡大鼠骨質影響

作者：裴凌鵬，董�；�，惠伯棣

作者單位：中國中醫科學院骨傷科研究所，北京 100700；北京聯合大學應用文理學院

【摘要】 目的研究ASTA蝦青素對D-半乳糖致衰老大鼠骨質的影響。方法用D-半乳糖注射Wistar雄性大鼠5個月，建立衰老模型，測定青年對照組、致衰老模型組、蝦青素組和正常老齡對照組骨常規參數并進行比較分析。結果致衰老模型組骨密度、骨結構力學參數、生物力學參數、骨鈣、鎂、錳及羥脯氨酸含量與青年對照組比較有所降低，差異有統計學意義(P<001)；而骨磷含量、骨和血清堿性磷酸轉移酶與青年對照組比較有所升高，差異有統計學意義(P<001)；這些變化與正常老齡對照組的變化趨勢一致，并比后者變化得更顯著。相比之下，蝦青素組在上述參數指標與致衰老模型組比較差異有統計學意義(P<001)。結論長期大量攝入D-半乳糖導致大鼠衰老同時可能誘發其發生骨質變化，而蝦青素可以預防或降低此類致衰老骨質變化的發生。

【關鍵詞】 骨質疏松,骨密度,羥脯氨酸,蝦青素

D-半乳糖衰老機制是指在一定時間內，給動物連續注射大劑量的D-半乳糖，使機體細胞內半乳糖濃度增高。在醛糖還原酶的催化下，還原成半乳糖，該物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響細胞的正常生理代謝，導致機體衰老。衰老過程常會伴隨著老年性骨質疏松癥的發生，因此，利用致衰老模型探索致老年性骨質疏松癥發病機制具有一定的研究價值。蝦青素是一種非維生素A原的羥酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的海洋動物體、藻體及少數陸生植物體內并具有多種生物學功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用明顯。本實驗旨在通過ASTA蝦青素對骨質常參數如骨密度、骨結構力學參數、生物力學參數、主要骨礦物質(鈣、鎂、錳、磷)、血清磷鈣、羥脯氨酸含量及堿性磷酸酶活性等來研究此類化合物對D-半乳糖致衰老大鼠骨質的影響。

1 材料與方法

11 主要儀器和試劑 Labconco冰凍真空干燥儀(法國樂高公司)；752分光光度計、AE100電子天平(中國伯樂公司)；電熱三用水箱、KA-1000型臺式離心機(中國杭州華亭公司)；960型熒光分光光度計、J2-SH高速冰凍離心機、Lunar-XR型雙能X線骨密度測定儀、島津萬能實驗機、火焰原子吸收分光光度計(日本島津公司)；C30柱(YMC Carotenoid S-5,Waters)高效液相色譜(HPLC)(Waters 600E溶劑輸送系統，PDA-2996二極管陣列檢測器Waters),丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定度劑盒(南京建成生物工程研究所)；蝦青素乳化劑(瑞士羅氏公司)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(美國迪馬公司)；無水乙醇(北京化學試劑公司)；大孔吸附樹脂(天津農業股份公司)。

12 乳化劑破乳制備蝦青素

121 蝦青素萃取稱取10g乳化顆粒，加入300ml丙酮-正己烷萃取。將脂溶性相收集，再進行濃縮處理。

122 蝦青素提取液柱色譜純化 (1)裝柱：將活化好的氧化鋁裝填于玻璃層析柱中，用正己烷潤濕。(2)洗脫：分別取2ml蝦青素提取液上柱，用50ml正己烷-丙酮淋洗，收集洗脫液。將洗脫液用氮氣吹干制粉備用。

13 蝦青素鑒定 根據其高效液相色譜(HPLC)中保留時間和紫外可見吸收光譜的特征峰與標準品對照進行鑒定。

14 動物實驗

141 D-半乳糖致衰老動物骨質疏松癥模型的建立 6周齡Wistar雄性大鼠45只隨機分為3組，即致衰老模型組、青年對照組和蝦青素組，每組15只，另購16月齡同品系大鼠15只作為正常老齡對照組。致衰老模型組和蝦青素組每天用15g/(kg·bw)的D-半乳糖頸背部皮下注射，劑量為01ml/10g，其中蝦青素組每天每只以02ml灌喂20mg/(kg·bw)，所用蝦青素由本實驗室提供。青年對照組注射等量的生理鹽水，每天1次，連續注射5個月，自由進食進水。實驗結束時稱量鼠的體重并取各組大鼠，稱重后乙醚麻醉，暴露腹部，下腔靜脈取血，待測血清中MDA含量、血清鈣、血清磷、血清堿性磷酸酶(ALP)，血中SOD活性；分離各組大鼠的雙側股骨，測定骨長度、骨質量、骨密度、骨結構及生物力學指標；骨中鈣、磷、錳、鎂、羥脯氨酸含量和骨中ALP活性。

142 生化指標測定 MDA含量測定硫代巴比妥酸(TBA)比色法；SOD活性測定采用亞硝酸鹽法。

143 其他測定指標血清ALP活性采用氨基氨替比啉測酚法測定；血清鈣用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法；血清磷采用孔雀綠微量比色法；骨中ALP采用化學免疫法試劑盒測定(中國科學院生物物理所中生公司)。

144 股骨骨密度測定取股骨解凍后置于骨密度測定儀上，分近段、骨中段、遠段3部分測其骨密度。近段和遠段代表松質骨骨密度，骨中段代表皮質骨骨密度。測定參數：掃描寬度20nm，掃描速度7mm/s。

145 骨結構力學和生物力學的測定取大鼠左股骨，用千分尺測量右側股骨的長度；用分析天平稱量兩側股骨的重量；將股骨標本進行3點彎曲實驗，得到載荷-撓度曲線。由此曲線可直接得出大鼠骨的結構力學參數(****載荷、****撓度、彈性載荷、彈性撓度)。測定參數為：下壓速度10mm/min;下壓幅度4mm；保持時間5s；跨度22mm。斷骨后，取股骨中部作徑向切片，在顯微鏡下用顯微盡測量股骨的****外徑A、最小外徑B、****內徑a、最小內徑b。并計算出大鼠股骨的各項生物力學指標。

146 骨中鈣、錳、鎂的含量取大鼠右側股骨近端稱重，研碎。然后進行灰化2h。取出骨灰，硝酸溶解。經處理后，火焰原子吸收分光光度計測定鈣、錳、鎂的含量。

147 骨中磷的含量取大鼠右側股骨近端稱重，研碎。然后進行灰化2h。取出骨灰，硫酸溶解。經處理后，用鉬藍顯色定磷法于660nm波長下測定。

148 骨中羥脯氨酸的含量取大鼠右側股骨上端稱重，研碎。用3ml氯仿-甲醇處理2h，過濾。再用乙醇水和丙酮沖洗1次，放入烤箱2h。取出后放入1ml 12mol/l的HCl水解2h，取出后處理用氯胺T法于560nm波長下測定。

15 統計分析采用SPSS110統計軟件進行齊性檢驗并作方差分析。

2 結果

21 蝦青素提取與鑒定 有機試劑的反復提取后，通過柱層析洗脫后可以得到高純度的蝦青素提取物，經HPLC及其光譜特征峰鑒定為反式蝦青素單體。

22 D-半乳糖大鼠衰老模型建立 與青年對照相比，致衰老模型組血清MDA含量升高，而血液SOD活性均有所降低，與正常老齡對照組變化趨勢一致，說明D-半乳糖大鼠衰老模型建立成功。而蝦青素組與致衰老模型組比較，血清MDA含量升高，血液SOD活性降低，且差異有統計學意義(P<001)。

表1 血清MDA含量和血液SOD活性（略）

注：各組與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001

23 股骨結構力學、生物力學指標測定 與青年對照組比較，正常老齡對照組在股骨重量、長度明顯增加，而致衰老模型組2項指標明顯減少。而在股骨密度、結構力學和生物力學指標方面表明，正常老齡對照組和致衰老模型組與青年對照組比較，差異有統計學意義(P<005)。正常情況下隨年齡的增長，大鼠股骨長度和重量都會相應增加，同時由于各種內外因素其股骨的結構力學和生物力學將呈現下降趨勢。實驗結果表明，注射D-半乳糖5個月可以達到改變股骨結構力學和生物力學的指標，且作用與正常老齡大鼠變化趨勢一致，證明在建立D-半乳糖致衰老模型的同時，也可以導致老年性骨質疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組比較，骨密度、結構力學和生物力學參數指標均有所升高，且差異有統計學意義(P<005)。

表2 股骨結構力學、生物力學指標（略）

注：各組與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<005,d P<001

24 骨礦物質含量、血鈣磷及ALP活性 與青年對照組比較，致衰老模型組和正常老齡對照組骨鈣、錳、鎂及血磷含量均明顯減少，差異有統計學意義(P<001)，表明注射D-半乳糖的大鼠骨中幾種重要的礦物質含量比同齡正常大鼠有所降低，而與正常老齡對照組的骨礦物質含量變化趨勢一致。再次證明長期服用D-半乳糖可以導致老年性骨質疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組相比，骨鈣、錳、鮮及血磷含量均明顯升高，且差異有統計學意義(P<001)。與青年對照組比較，致衰老模型組和正常老齡對照組骨中羥脯氨酸含量均明顯減少，差異有統計學意義(P<001)。致衰老模型組血清ALP和骨ALP活性與青年對照組比較顯著升高；致衰老模型組與正常老齡對照組血清ALP活性比較也有所升高，2組變化趨勢一致。而蝦青素組與致衰老模型組比較，羥脯氨酸含量明顯升高，血清ALP和骨ALP活性較明顯降低，且差異有統計學意義(P<001)。

表3 骨礦物質含量、血鈣磷及ALP活性測定（略）

注：各級與青年對照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001,d P<001

3 討論

研究表明，大量的活性氧攝入會從整體、細胞和基因不同水平層次上影響骨的代謝過程。當大量進食D-半乳糖會產生過多的自由基，在骨重建中，自由基可以破壞膠原蛋白形成，導致骨中礦物質沉積減少，從而造成鈣、磷、鎂、錳等元素的流失，影響骨密度，抑制骨的形成，造成老年骨質疏松。同時膠原蛋白加速分解生成羥脯氨酸并隨血、尿流失，且隨年齡而增加，使得骨中兩者的含量均相應減少。另外由于骨基質結構建成受阻，同時礦物質含量下降，從而使骨的結構力學和生物力學受到了影響，大大降低了骨的抗變性能力，提高了發生骨折的機率。研究發現，蝦青素可以有效地緩解增強成骨細胞增殖和分化，同時對局部細胞因子(如ALP酶、Ⅰ型膠原蛋白等)具有上調作用，表明蝦青素可能參與骨代謝有關調節活動，再加上其極強的抗氧化能力，或許對致衰老性骨質疏松癥具有一定預防或輔助治療意義。本實驗中青年對照組血清ALP活性低于致衰老模型組和正常老齡對照組，而致衰老模型組又高于正常老齡對照組，這可能是由于晚期糖化終末產物(AGEs)濃度增加，使破骨過程顯著增強，成骨過程繼發增加，骨代謝處于一種高轉變狀態，成骨細胞的活躍造成血ALP活性增加。綜上所述，本實驗通過有關骨質疏松癥的相關指標檢驗，證實D-半乳糖誘導衰老大鼠過程的同時，可能誘發致衰老性骨質疏松。而ASTA蝦青素可有效地緩解此類致衰老性骨質變化。